TIANSeq mRNA ڪيپچر ڪٽ

في الحال ، اعليٰ نتيجن واري ترتيب واري ٽيڪنالاجي بنيادي طور تي ايندڙ نسل جي تسلسل واري ٽيڪنالاجي تي ل آھي. جيئن ته ايندڙ نسل جي تسلسل ٽيڪنالاجي جي پڙهڻ جي ڊيگھ محدود آھي ، اسان کي لازمي آھي ته پوري ڊيگھ جي تسلسل کي نن smallن ٽڪرن واري لائبريرين ۾ تسلسل ڏانھن ي. مختلف تسلسل تجربن جي ضرورتن جي مطابق ، اسان عام طور تي چونڊيندا آھي اڪيلو ختم ٿيندڙ تسلسل يا doubleيڻو ختم ٿيندڙ تسلسل. في الحال ايندڙ نسل جي تسلسل واري لائبريريءَ جا DNA ٽڪرا عام طور تي 200-800 bp جي حد ۾ ورھايل آھن.

a) ڊي اين اي ناقص آهي معيار ۾ ۽ ان ۾ روڪيندڙ شامل آهن. استعمال ڪريو اعليٰ معيار جا DNA نمونا انزائم سرگرمي جي روڪ کان بچڻ لاءِ.

ب) ڊي اين اي نموني جي مقدار نا مناسب آهي جڏهن پي سي آر فري طريقو استعمال ڪندي ڊي اين اي لائبريري اهي. جڏهن ٽڪرا ٽڪرا ٿيل ڊي اين اي جو داخلا 50 اين جي کان وي و ،ي ، پي سي آر کان پاڪ ڪم جو وهڪرو چونڊجي ڪري لائبريري جي تعمير جي عمل دوران ڪري سگهجي ٿو. جيڪڏھن لائبريريءَ جو ڪاپي نمبر تمام گھٽ آھي س directlyو سنئون ترتيب ڏيڻ لاءِ ، ڊي اين اي لائبريري کي پي سي آر ذريعي اڊاپٽر ليگيشن کان پوءِ و ampائي سگھجي ٿو.

ج) آر اين اي آلودگي سبب ٿي سگھي ٿي غلط ابتدائي ڊي اين اي مقدار جي درستگي آر اين اي آلودگي موجود ھوندي آھي جينومڪ ڊي اين اي جي صفائي واري عمل ۾ ، جيڪا ٿي سگھي ٿي غلط ڊي اين اي مقدار جي درستگي ۽ لائبريري جي تعمير دوران نا مناسب ڊي اين اي لوڊ ڪرڻ. RNA کي ختم ڪري سگھي ٿو RNase سان علاج ڪرڻ سان.

A-1

a) نن fragا ٽڪڙا (60 bp-120 bp) ظاھر ٿين ٿا نن fragا ٽڪرا عام طور تي اڊاپٽر جا ٽڪرا يا ڊيمر آھن جيڪي اڊاپٽرز formedاھيندا آھن. پاڪ ڪرڻ سان Agencourt AMPure XP مقناطيسي موتي ان اڊاپٽر جي ٽڪرن کي مؤثر طريقي سان ختم ڪري سگھن ٿا ۽ تسلسل جي معيار کي يقيني بڻائي سگھن ٿا.

b) پي سي آر وlائڻ کان پوءِ لائبريريءَ ۾ وڏا ٽڪرا نظر اچن ٿا لائبريري ڊي اين اي جي ٽڪڙي جو سائيز 120 bp و increaseي ويندو جڏهن ايڊاپٽر لگيٽ ٿي ويندو. جيڪڏھن ڊي اين اي جو ٽڪرو و bي ٿو 120 بي پي کان و theيڪ اڊاپٽر ليگيشن کان پوءِ ، اھو ٿي سگھي ٿو غير معمولي ٽڪرا و ampائڻ جي ڪري و PCيڪ پي سي آر وlائڻ جو. PCR سائيڪلن جو تعداد گھٽائڻ صورتحال کي روڪي سگھي ٿو.

ج) لائبريري جي غير معمولي سائيز ڊي اين اي جا ٽڪرا اڊاپٽر ليگيشن کان پوءِ ھن کٽ ۾ اڊاپٽر جي ڊيگھ 60 bp آھي. جڏهن ٽڪرن جا endsه پاسا اڊاپٽرز سان لايا ون ٿا ، ڊيگهه ر increaseو 120 bp و increaseي ويندي. جڏھن استعمال ڪريو ھڪڙو اڊاپٽر ان کان سواءِ جيڪو ھن کٽ پاران مهيا ڪيو ويو ھجي ، مھرباني ڪري سپلائر سان رابطو ڪريو لا relevantاپيل معلومات مهيا ڪرڻ لاءِ جيئن اڊاپٽر ڊگھائي. مھرباني ڪري يقيني بڻايو ته تجربي جي ڪم جو فلو ۽ آپريشن ھدايتن ۾ بيان ڪيل قدمن تي عمل ڪريو.

d) غير معمولي ڊي اين اي ٽڪرا سائيز اڊاپٽر ليگيشن کان ا The ھن مسئلي جو سبب ٿي سگھي ٿو غلط رد عمل جي حالتن جي ڪري ڊي اين اي ٽڪرن جي دوران. مختلف رد عمل جا وقت استعمال ٿيڻ گھرجن مختلف ڊي اين اي ان پٽ لاءِ. جيڪڏھن ڊي اين اي ان پٽ 10 اين جي کان ويڪ آھي ، اسان صلاح ڏيون ٿا ته رد عمل جو وقت چونڊيو 12 منٽ اصلاح جي شروعاتي وقت جي طور تي ، ۽ ھن وقت پيدا ٿيل ٽڪرا سائيز بنيادي طور تي 300-500 بي پي جي حد ۾ آھي. استعمال ڪندڙ ڊي اين اي جي ٽڪرن جي ڊيگھ و increaseائي يا گھٽائي سگھن ٿا 2-4 منٽن لاءِ پنھنجي ضرورتن مطابق ڊي اين اي ٽڪرن کي مطلوب سائيز سان.

A-2

a) ٽڪرا ٽڪرا ڪرڻ جو وقت بھتر نه آھي جيڪڏھن ٽڪرا ٿيل DNA تمام نن orو يا تمام وڏو آھي ، مھرباني ڪري حوالا ڏيو ٽڪر ٽڪر وقت جي چونڊ لاءِ ھدايتن ۾ ڏنل هدايتن ۾ ڏنل رد عمل جو وقت طئي ڪرڻ لاءِ ، ۽ ھن ٽائيم پوائنٽ کي بطور ڪنٽرول استعمال ڪريو ، اضافي طور تي ھڪڙو سيٽ اپ ڪريو. رد عمل جو نظام ڊگھو يا نن minو ڪرڻ لاءِ 3 منٽ و toيڪ درست ترتيب ڏيڻ لاءِ ٽڪرن جي وقت تي.

A-3

ٽڪرن جي علاج کان پوءِ ڊي اين اي جي غير معمولي سائيز جي ور

a) ٽُڪر ٽُڪرڻ جو غلط پگھلڻ وارو طريقو ، يا پگھلڻ کانپوءِ ريجنٽ مڪمل طور تي ملايو نه ويندو آھي. 5 × Fragmentation Enzyme Mix reagent کي برف تي پگھل ڪريو. هڪ tيرو پگھرجي و ،ڻ ، ريجنٽ کي ملايو هڪجهڙائي سان نرميءَ سان ٽيوب جي هي bottomئين پاسي کي. رد عمل کي orيرو نه ڏيو!

ب) ڊي اين اي ان پٽ نموني تي مشتمل آهي EDTA يا utيا آلودگي وارا نمڪ آئنز جي گھٽتائي ۽ ڊي اين اي صاف ڪرڻ واري مرحلي ۾ چيليٽنگ ايجنٽ خاص طور تي تجربي جي ڪاميابي لاءِ اھم آھن. جيڪڏھن ڊي اين اي olvedلجي و 1ي 1 × TE ۾ ، استعمال ڪيو ھدايت ۾ ڏنل طريقو استعمال ڪريو ٽڪرا ٽڪرا ڪرڻ لاءِ. جيڪڏھن حل ۾ EDTA جو غلبو غير يقيني آھي ، اھو سفارش ڪئي وئي آھي ته ڊي اين اي کي پاڪ ڪيو و itي ۽ ان کي ionھلائي ionڏيو پاڻيءَ ۾ ايندڙ رد عمل لاءِ.

ج) غلط ابتدائي ڊي اين اي مقدار جو اندازو ٽڪرا ٿيل ڊي اين اي جي ماپ ويجھي سان تعلق رکي ٿي ڊي اين اي ان پٽ جي مقدار سان. ٽڪرا ٽڪرا ڪرڻ کان ا، ، ردوبدل واري نظام ۾ ڊي اين اي جي صحيح مقدار جو تعين ڪرڻ لاءِ Qubit ، Picogreen ۽ methodsين طريقن کي استعمال ڪندي ڊي اين اي جي درست مقدار درست ڪرڻ ضروري آھي.

 د) رد عمل واري نظام جي تياري هدايتن تي عمل نٿي ڪري ٽڪرا ٽڪرا ٿيل رد عمل واري نظام جي تياري لازمي طور تي برف تي سختي سان ھدايتن مطابق ڪئي وي. بهترين اثر کي يقيني بڻائڻ لاءِ ، س reactionئي رد عمل جا جزا برف تي رکيا و andن ۽ رد عمل واري نظام جي تياري مڪمل ٿingي ٿيڻ کانپوءِ ڪئي وي. تياري مڪمل ٿيڻ کان پوءِ ، مھرباني ڪري فلڪ ڪريو يا پائيپ کي چ mixيءَ طرح ملائڻ لاءِ. وير نه ڪريو!

1. ناجائز ميلاپ جو طريقو (وراٽ ، پرتشدد oscڪتاڻ ، وغيره) سبب ٿيندو لائبريري جي ٽڪرن جي غير معمولي ور distribution (جيئن ھي the ڏنل شڪل ۾ ڏيکاريل آھي) ، اھڙي طرح لائبريريءَ جي معيار کي متاثر ڪندو. تنھنڪري ، جڏھن فريگريشنٽيشن ميڪس رد عمل جو حل تيار ڪري رھيا آھيو ، مھرباني ڪري مٿي ۽ ھي pipان پائپ ڪريو ميسيج ڪرڻ لاءِ ، يا فنگر ٽپ کي استعمال ڪرڻ لاءِ ۽ mixيڻي طرح ملائڻ لاءِ. محتاط رھو نه ته وھور سان ملجي.

2. اعليٰ پاڪائيءَ وارو DNA ضرور استعمال ڪيو و libraryي لائبريري جي تعمير لاءِ

■ س DNAي ڊي اين اي سالميت: اليڪٽرروفورسس بينڊ 30 kb کان و isيڪ آھي ، بغير پگھاري جي

■ OD260/230:> 1.5

■ OD260/280: 1.7-1.9

3. ڊي اين اي ان پٽ جي مقدار درست ھجڻ گھرجي. تجويز ڪيو ويو آھي ته ڪوببٽ ۽ پيڪو گرين طريقا استعمال ڪريو ڊي اين اي کي مقدار ڏيڻ لاءِ ، نانوڊروپ جي بجاءِ.

4. EDTA جو مواد DNA حل ۾ ضرور طئي ڪيو و EDي EDTA جو ٽڪرن جي رد عمل تي وڏو اثر آھي. جيڪڏھن EDTA جو مواد و highيڪ آھي ، ڊي اين اي صاف ڪرڻ جي ضرورت آھي ايندڙ ٽيسٽ کان پھريائين.

5. ٽڪرن جي رد عمل جو حل برف تي تيار ھجڻ گھرجي. رد عمل جي وقت جي درستگي کي يقيني بڻائڻ لاءِ ، مھرباني ڪري تيار ڪريو رد عمل جو نظام برف تي.

6. ٽڪرن جي رد عمل جو وقت درست ھجڻ گھرجي. ٽڪرن واري مرحلي جو رد عمل وقت س directlyو سنئون ٽڪرن جي شين جي سائيز کي متاثر ڪندو ، اھڙي طرح لائبريري ۾ ڊي اين اي ٽڪرن جي سائيز جي ورing کي متاثر ڪندو.

1. ھن کٽ تي ڪھڙي قسم جو نمونو لاو آھي؟

ھن کٽ جو قابل اطلاق نمونو قسم ٿي سگھي ٿو ڪل RNA يا پاڪ mRNA س Rو RNA سالميت سان. جيڪڏھن ڪل آر اين اي لائبريري constructاھڻ لاءِ استعمال ڪيو و ،ي ، اھو سفارش ڪئي وئي آھي ته استعمال ڪريو آر آر اين اي ختم ڪرڻ واري ڪٽ (#لي#4992363/4992364/4992391) پھريائين آر آر اين اي کي ھٽائڻ لاءِ.

2. Fا FFPE نموني استعمال ڪري سگھجن ٿا لائبريري constructاھڻ لاءِ ھن کٽ سان؟

FRPE نمونن ۾ mRNA ھڪڙي حد تائين گھٽجي ويندو ، نسبتا poor ناقص سالميت سان. جڏھن ھن ڪٽ کي استعمال ڪندي لائبريري جي تعمير لاءِ ، اھو تجويز ڪيو ويو آھي ته ٽڪرن جي وقت کي بھتر ڪريو (ٽڪرا ٽڪرا ڪرڻ جو وقت گھٽ ڪريو يا ٽڪرا ٽڪرا نه ڪرڻ).

3. پروڊڪٽ جي دستيابي ۾ ڏنل سائيز جي چونڊ واري مرحلي کي استعمال ڪندي ، mightا ٿي سگھي ٿو داخل ٿيل segmentا slightي کي معمولي انحراف ظاھر ڪرڻ جو؟

سائيز جي چونڊ ڪئي ويندي سخت مطابق مطابق سائيز جي چونڊ مرحلي جي ھن پراڊڪٽ جي دستيابي ۾. جيڪڏھن اتي انحرافي آھي ، اھو سبب ٿي سگھي ٿو ته مقناطيسي موتي متوازن نه آھن ڪمري جي گرمي پد تي يا مڪمل طور تي نه ملايا ويا آھن ، پائيپٽ درست ناھي يا مائع ٽپ ۾ رھيو آھي. اھو تجويز ڪيو ويو آھي استعمال ڪرڻ لاءِ تجويزون گھٽ استعمال ڪرڻ لاءِ تجربي لاءِ.

4. لائبريري جي تعمير ۾ اڊاپٽرز جو انتخاب

لائبريري جي اڏاوت واري کٽ ۾ اڊاپٽر ريجنٽ شامل ناهي ، ۽ اها سفارش ڪئي وئي آهي ته هن ڪٽ کي گڏجي استعمال ڪريو TIANSeq Single-Index Adapter (Illumina) (4992641/4992642/4992378) سان.

5. لائبريريءَ جو QC

لائبريري مقدار جي س detاڻپ: Qubit ۽ qPCR استعمال ڪيا ون ٿا لائبريري جي ماس ڪنسنٽريشن ۽ مولر ڪنسنٽريشن کي ترتيب ڏيڻ لاءِ. آپريشن سختيءَ سان آھي پيداوار جي دستيابي مطابق. لائبريريءَ جو حراست عام طور تي اين جي ايس تسلسل جي ضرورتن کي پورو ڪندي. لائبريري ڊسٽريبيوشن رينج جو پتو ل :ائڻ: استعمال ڪرڻ Agilent 2100 Bioanalyzer لائبريري ڊسٽريبيوشن رينج کي ولڻ لاءِ.

6. امپليفيشن سائيڪل نمبر جو انتخاب

ھدايتن مطابق ، پي سي آر سائيڪلن جو تعداد آھي 6-12 ، ۽ گھربل آھي پي سي آر سائيڪلن جو تعداد چونڊڻ گھرجي نموني ان پٽ جي مطابق. و yield ۾ و پيداوار واري لائبريرين ۾ ، و ampائڻ و usuallyائڻ عام طور تي مختلف درجن ۾ ٿئي ٿو ، جيڪو ظاھر ٿئي ٿو ٿوري وڏي چوٽيءَ کان پوءِ ٽارگيٽ رينج جي چوٽي کان پوءِ Agilent 2100 Bioanalyzer جي ectionولا ۾ ، يا Qubit جي concentrationوليل حراست qPCR جي lowerيٽ ۾ گھٽ آھي. و over ۾ و amp و ampائڻ هڪ عام رجحان آهي ، جيڪو لائبريري جي تسلسل ۽ ان کان پوءِ جي ڊيٽا تجزيي کي متاثر نٿو ڪري.

7. Spikes نظر اچن ٿا ileولڻ واري پروفائل Agilent 2100 Bioanalyzer جي

Agilent 2100 Bioanalyzer جي سectionاڻپ ۾ چشمن جو ظاھر ٿيڻ آھي samplesاڪاڻ ته نمونن جي اڻ برابري واري ٽڪرن جي ، جتي مخصوص سائيز ۾ و moreيڪ ٽڪرا ھوندا ، ۽ اھو PCR افزودگيءَ کان پوءِ و obviousيڪ واضح ٿي ويندو. ان صورت ۾ ، تجويز ڪيو ويو آھي سائيز جي چونڊ کي انجام نه ڏيڻ ، يعني ٽڪرن جي حالت مقرر ڪريو 94 ° C تي 15 منٽن لاءِ ، جتي ٽڪرن جي ور small نن smallي ۽ مرڪوز آھي ، ۽ ھڪجھڙائي کي بھتر ڪري سگھجي ٿو.